阿片类药物是目前临床广泛使用的强效镇痛药物。但镇痛的同时还会引起大脑中强烈的兴奋作用,停药会引起难以忍受的戒断症状,从而导致成瘾。
2023年1月19日,西安交通大学国家生物证据安全基地与厦门大学医学院、西安精神卫生中心等单位合作在Cell杂志发表文章揭示了阿片类药物驱动脆弱样调节性 T 细胞的外周扩张,这些细胞穿过血脑屏障,并通过 IFN-γ 介导突触不稳定和随后的戒断症状。阿片类药物成瘾尚无有效治疗方法,这一研究提出了通过远端免疫治疗靶向对抗中枢神经系统功能障碍的可能,有望通过免疫干预治疗阿片成瘾。
免疫系统失调是阿片类药物成瘾的一个主要特征。研究人员描述了阿片类药物使用障碍患者和健康对照者的外周免疫细胞的情况。阿片类药物相关血液中的免疫细胞出现异常分布,其特征是脆弱样调节性 T 细胞显著扩张,与戒断评分呈正相关。
阿片类药物治疗的小鼠也表现出 Treg 衍生的干扰素-γ (IFN-γ) 表达增强。IFN-γ 信号重塑了伏隔核 (NAc) 神经元的突触形态,调节随后的戒断症状。研究证明阿片类药物通过下调星形胶质细胞衍生的脂肪酸结合蛋白 7 (Fabp7) 来增加神经元衍生的 C-C 基序趋化因子配体 2 (Ccl2) 的表达并破坏血脑屏障的完整性,这两者触发了外周 T细胞浸润至 NAc。
这一研究表明,阿片类药物会驱动脆弱样调节性T细胞的扩张,并有利于外周调节性T细胞穿过血脑屏障,从而导致IFN-γ介导的突触不稳定和随后的戒断症状。
阿片类药物具有强效镇痛作用,但是由于其强烈的兴奋作用,这类药物也是最容易上瘾的。NAc是调节奖赏和厌恶过程的关键脑区。吗啡诱导的NAc区域形态重塑与行为敏化、依赖和戒断有关。此外,吗啡可促进炎症因子的分泌,加重神经免疫反应。然而外周免疫细胞及其分泌的细胞因子是否与中枢神经系统(CNS)相互作用以调节突触结构或成瘾行为仍然是未知的。
调节性T细胞(Tregs)是一类控制体内自身免疫反应性的T细胞亚群,在免疫抑制中具有关键作用,其标志物为转录因子Foxp3,该功能性细胞群缺失后引起致命的自身免疫性疾病。脆弱样Tregs保留Foxp3表达但失去抑制功能。缺氧导致HIF1α表达升高,进而引起脆弱样Tregs产生IFN-γ。
本研究报道了阿片类药物使用障碍患者中脆弱样Tregs群的扩大,其特征是分泌 IFN-γ 以及持续表达 HIF1α。施用阿片类药物后,在小鼠的血液和 NAc 中也发现了类似的亚群。此外,脆弱样Tregs产生的IFN-γ会导致突触功能障碍和随后的戒断症状。研究人员进一步确定了脆弱样Tregs穿过血脑屏障的机制。
这一研究项目招募了阿片类药物使用障碍患者21例(其中男18例,女3例),平均年龄40.7±9.0岁;健康对照组20例(男17例,女3例),平均年龄(35.8±3.6)岁。对人的外周血单核细胞 (PBMCs)样本进行质谱流式细胞分析;提取PBMCs的总RNA进行基因表达分析。
动物实验选用6-8周龄雄性小鼠,每隔3天给小鼠腹腔注射200 mg/剂量的抗鼠IFN-γ以在体内阻断IFN-γ。每天给对照组小鼠腹腔注射两次盐水;连续7天给实验组小鼠注射吗啡(从 10 至 50 mg/kg 递增;或 5 至 10 mg/kg递增连续28天),在吗啡注射后30分钟测定小鼠动脉血氧饱和度,最后一次注射后48小时收集组织样本。监测并记录吗啡戒断48小时后的小鼠躯体症状。每组随机取三只小鼠,获取NAc组织,进行一系列免疫实验。提取NAc组织的总RNA进行TCR免疫组库测序分析。测定小鼠血脑屏障渗透性,并对小鼠脑组织结构形态进行显微成像分析。
1. 阿片类药物引起外周脆弱样Tregs增加
对阿片类药物使用障碍患者外周血的分析表明,不同免疫细胞亚群中的多种抑制标记物和激活标记物均有所增强(图 1F)。转录因子Foxp3在各种细胞亚群中广泛共表达,在阿片类药物相关血液中显著增加(图 1G)。Foxp3High细胞共表达CCR7、CD45RA和CD163等(图1H、1I)。在阿片类药物使用障碍患者的PBMCs中,一系列细胞因子基因和指示细胞激活的基因表达增加(图1J)。流式细胞术分析显示血液中的Tregs及其产生的IFN-γ水平升高(图1K),而在其他细胞亚群中没有观察到明显的IFN-γ水平变化。阿片类药物相关血液中的IFN-γ+细胞高表达HIF1α和IFNG(图1L和1M),说明血液中脆弱样Treg亚群增多。
研究发现 Foxp3 和 CD163 之间呈现显著的正相关性。Foxp3表达与戒断评分呈正相关性(图 1N和1O)。此外,Tregs 衍生的 IFNG 相对表达水平与戒断评分呈正相关(图 1P),表明脆弱样Tregs可能参与阿片类药物引起的戒断症状。
图1阿片类药物使用障碍患者外周免疫环境的鉴定
2. 吗啡导致NAc区域脆性样Tregs浸润和突触可塑性
研究人员在吗啡治疗小鼠的NAc组织中检测到大量Foxp3+细胞,并且增多的IFN-γ+细胞显示出CD4+Foxp3+ Tregs的特征(图 2D)。为了研究浸润T细胞是否源自外周血或NAc 中常驻T细胞的增殖,通过IR-seq检测TCR β链克隆型。吗啡治疗后检测到V、VJ、VDJ 和CDR3 aa克隆型增多(图2J-2K)。吗啡处理后,NAc中CDR3 aa 克隆型的多样性显著升高(图2L、2M)。
这些数据表明阿片类药物会诱导外周T细胞浸润。吗啡处理组的NAc神经元粗刺和细刺的比例分别减少和增加(图2N-2P),这表明吗啡暴露后中型棘突神经元(MSN)的未成熟/不稳定突触结构增加。然而,在吗啡处理的小鼠中,不对称突触的数量和这些突触活跃区的长度分别增加和减少(图2Q 和 2R),这表明兴奋性突触功能减弱。这些形态学变化结果表明吗啡处理会导致NAc中的突触减弱。
图2 阿片类药物治疗导致NAc中脆弱样Treg浸润和突触可塑性
3. 消除IFN-γ可防止NAc突触减弱
为了确定IFN-γ是否影响NAc中的突触可塑性,在吗啡治疗前给小鼠施用IFN-γ(抗 IFN-γ)。阻断IFN-γ并不能阻止Tregs浸润,但会降低NAc中的IFN-γ水平。同时,神经元粗刺的比例增加,细刺的比例减少(图3D、3E)。此外,这些突触活动区的长度增加,表明突触功能加强(图3F)。形态学结果表明潜在的突触弱化效应被阻止了。与吗啡处理的小鼠一样,IfngcKO小鼠也显示Tregs浸润到NAc中(图3G)。然而,吗啡治疗后,NAc 中Tregs产生的IFN-γ量显著减少(图3H、3I)。
图3 消除IFN-γ可防止NAc诱导的突触减弱
4. NAc神经元IFN-γ信号调节突触可塑性
为了评估IFN-γ在神经元信号传导中的作用,研究人员使用hsyn驱动的tet-on系统降低了NAc中IFN-γ受体 R1 (Ifngr1) 的表达水平。Ifngr1 shRNA有效降低了Ifngr1表达,但不降低IFN-γ水平(图4D)。免疫荧光染色显示,吗啡治疗后,NAc中Stat1(IFN-γ 信号通路中的响应基因)的表达增加。当Ifngr1下调时,增强型Stat1被tet-on系统抑制(图4E)。Wnt家族和Bst2是IFN-γ信号传导的靶标,在突触形成和损伤中发挥关键作用。
研究人员进一步检测了NAc中Wnt10b和Bst2的表达。阻断IFN-γ信号传导抑制了吗啡诱导的 Wnt10b 表达(图 4F),而 Bst2 表达则无明显变化。当Ifngr1被敲低后,吗啡诱导的突触减弱不再发生(图 4G-4K)。阻断IFN-γ信号传导后,戒断症状也得到了改善(图4L)。这些数据表明,吗啡激活IFN-γ信号,诱导 NAc 的高度突触可塑性。
图4 NAc神经元IFN-γ信号调节突触可塑性
5. 阿片类药物促进Ccl2介导的Treg募集
与对照组相比,吗啡处理后NAc中的Ccl2表达增加,而血液中的Ccl2没有显著差异,表明Ccl2的增加源于NAc(图5A)。免疫荧光分析表明,增多的Ccl2来自神经元而非星形胶质细胞(图5B)。虽然敲除Treg中的Ccr2并不会改变神经元中Ccl2的表达(图5C),但吗啡处理的Ccr2cKO小鼠显示出较少的Treg浸润、较低的IFN-γ产生和Stat1表达(图5D-5F)。此外,吗啡诱导的突触减弱(图5G-5I)和戒断症状(图5J)在 Ccr2cKO小鼠中也得到了预防。Stat1 信号传导可以驱动神经元 Ccl2 表达。但是Ifngr1的下调不会改变吗啡诱导的Ccl2和Foxp3染色,表明吗啡促进神经元的Ccl2表达和Treg募集并不依赖于Stat1信号传导,而是神经元通过μ-阿片类受体产生Ccl2。
图5 Foxp3+特异性敲除 Ccr2可改善 NAc 中吗啡诱导的结果
6. 阿片类药物通过降低Fabp7破坏血脑屏障促进Tregs浸润
Fabp7的表达和IFN-γ的水平之间存在明显相关性。在吗啡处理的小鼠中,总Fabp7(图 6D)和星形胶质细胞衍生的Fabp7(图6E)均显著减少。研究人员利用伊文思蓝(EB)验证血脑屏障的渗透性,发现吗啡处理的NAc中EB外渗增加(图6F和6G)。IfngcKO小鼠还表现出吗啡诱导的Fabp7 mRNA和蛋白质减少(图6H和6I),说明Fabp7的减少是吗啡引起而不是通过IFN-γ引起的。恢复Fabp7的表达会显著降低NAc中IFN-γ的水平,但Fabp7过表达不影响血液中IFN-γ的量。研究人员发现这可以防止吗啡诱导的血脑屏障破坏(图7D、7E)和Treg浸润(图7F)。免疫荧光染色证明恢复星形胶质细胞中Fabp7的表达不会减少MSN产生的Ccl2(图 7G),表明Ccl2升高是吗啡造成,与Treg浸润无关。血脑屏障完整性的恢复确实减少了吗啡介导的Stat1表达,导致IFN-γ信号传导减少(图7H)。与对照组相比,吗啡处理的小鼠中Fabp7的上调可以挽救突触减弱并改善吗啡用药后的戒断症状。
图6 吗啡引发Fabp7减少和血脑屏障高通透性
图7 Fabp7对于阿片类药物相关的血脑屏障通透性至关重要
这项研究揭示了阿片类药物使用障碍患者的外周免疫情况。研究表明阿片类药物引起的缺氧引发的外周血来源的脆弱样Tregs会产生IFN-γ并渗透到NAc中,重塑突触可塑性,从而调节戒断症状。阿片类药物刺激不仅会增加MSN衍生的Ccl2,还会抑制星形胶质细胞衍生的 Fabp7,促进脆弱样Tregs进入中枢神经系统。这项研究阐明了脆弱样Tregs跨血脑屏障运输的机制,深入了解了IFN-γ信号通路在调节 MSN 结构和功能中的作用。这种“血脑屏障通透性/脆弱样Tregs 浸润/IFN-γ信号传导/戒断症状”轴可能为阿片类药物依赖患者开发有效的免疫治疗策略提供依据。
西安交通大学法医学院朱永生、严鹏为本文章的共同第一作者。该工作受到国家自然科学基金、陕西省自然科学基金、福建省自然科学基金以及厦门大学校长基金等资助和支持。
参考文献:
Zhu et al., Opioid-induced fragile-like regulatory T cells contribute to withdrawal, Cell (2023)